КЛОНИРОВАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ К+ КАНАЛОВ hERG ТИПА.
Токсическое действие многих лекарственных препаратов на сердце сводится к блокированию К+ каналов hERG типа и, как следствие, к пролонгированию фазы реполяризации и возникновению аритмий. Поэтому раннее выявление ингибирующих эффектов потенциального лекарства на активность К+ каналов, функционирующих в кардиомиоцитах, является важной задачей преклинического исследования. Нами проводились работы по получению клеточной линии, стабильно, воспроизводимо и на высоком уровне экспрессирующей рекомбинантные hERG каналы, что является необходимым условием для работы с клеточной тест-системой. Использовались два методически разных подхода, включая стандартную процедуру трансфекции клеток НЕК293 вектором pcDNA3.1 и трансфекция клеток СНО лентивирусным вектором pCDH1-MCS1-EF1-Puro. Получались субклоны клеток и исследовалась функциональная экспрессия hERG каналов методом patch clamp. Оценивалось среднее число активных каналов Np в различных субклонах, исходя из соотношения:
I = Npg(V-Vr) (1)
где I – ток, переносимый через ансамбль N функциональных каналов данного типа, p – вероятность найти канал в открытом состоянии, g - проводимость одиночного канала V и Vr – мембранный потенциал и потенциал реверсии тока, соответственно.
Рис.1 Среднее число hERG каналов на клетку в различных субклонах (e10-g3) pCDH1/HERG трансфецированных клеток CHO. Серый столбец - субклон клеток НЕК293, трансфецированных вектором pcDNA3.1/HERG, с максимальным уровнем экспрессии hERG каналов. Величина Np рассчитывалась на основе Ур.1 при g=13 пСм и Vr = (RT/F)log([K+]out/[K+]in)» 50 мВ при [K+]out = 40 мМ и [K+]in = 140 мМ.
ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТОКСИНОВ.
Канальные белки эволюционно отобраны для обеспечения регулируемого и селективного транспорта ионов и некоторых других субстанций через клеточные мембраны. Существует, однако, большое количество веществ различного происхождения, чье физиологическое действие обусловлено их способностью формировать трансмембранные поры и тем самым увеличивать проницаемость мембран. Таким свойством обладают некоторые природные пептиды, в частности - бактериальные токсины. Их естественным источником являются такие патогенные микроорганизмы, как Bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы), Staphylococcus aureus (возбудитель разнообразных гнойных инфекций), Bacillus cereus (вызывающий различные заболевания, например, кишечные инфекции) и др. Исследование подобных молекулярных образований представляет интерес с нескольких точек зрения. Во первых, такие исследования полезны для выяснения связи между структурой и функцией порообразующего белка. Учитывая, что основным фактором патогенности бактерий нередко являются секретируемые ими токсины, изучение последних целесообразно и с точки зрения фундаментальной медицины, одна из задач которой - установить молекулярные основы патогенеза. В качестве возможной прикладной сферы применения порообразующих токсинов рассматривается их использование в различных устройствах, имеющих наноскопические размеры, включая биосенсоры, мембраны с регулируемой селективностью и т.п.
Нами в частности исследовалась способность гемолизина II Bacillus cereus, индуцировать олигомерные ионные каналы в модельных и клеточных мембранах. Были оценены основные параметры открытой поры (проводимость, селективность, потенциалзависимость) при различных экспериментальных условияхб и были получены основные характеристики его гемолитической активности и измерен функциональный радиус пор в мембране эритроцита (0.6-0.8 нм). Полученные данные свидетельствуют о том, что гемолизин II может формировать в мембране и гекса-, гепто и октамерные поры, преимущественная сборка которых может зависеть от ионной силы и температуры окружающей среды (Рис.1).
Рис. 1. Молекулярная модель одиночной гемолизиновой поры, построенная на основе полученных экспериментальных данных. (Из Andreeva, Z. I.,. Nesterenko V.F, Fomkina M.G.,Ternovsky V.I., Suzina N.E, Bakulina A.Y, Solonin A.S., Sineva, E. V The properties of Bacillus cereus hemolysin II pores depend on environmental conditions. Biochim Biophys Acta, 2007, V.1768(2), P.253-263.
АТФ-БИОСЕНСОР.
Аденозин трифосфат (ATФ) используется центральной и периферической нервными системами в качестве нейротрансмиттера/нейромодулятора. Чтобы исследовать механизмы секреции ATФ одиночными клетками мы разработали метод для мониторинга нуклеотида во внеклеточном пространстве, основанный на регистрации активности клеток, способных отвечать на экстраклеточный ATФ. Использовались клетки линий НЕК-293 и COS-1, экспрессирующие эндогенные P2Y рецепторы, а также клетки линии HEK-293, трансфецированые кДНК, кодирующей P2X3-рецептор. По большинству показателей (порог чувствительности, время инактивации ATФ-ответа, рефрактерный период) клетки линии оказались COS-1 наиболее удобны для использования в качестве АТФ-сенсоров.. Клетки COS-1 генерируют ответы АТФ преимущественно за счет высвобождения депонированного Са2+. Последнее позволяет регистрировать активность исследуемых клеток электрофизиологическими методами и одновременно отслеживать их ATP секрецию по Са2+ ответам клеток COS-1. Данный методический прием, позволяет изучать секрецию в принципе любых сигнальных молекул, на которые существуют рецепторы, сопряженные с мобилизацией внутриклеточного Са2+.
Рис.1. Кальциевые ответы одной и той же клетки COS-1 при аппликации ATP в различных концентрациях. На вставке показана концентрационная зависимость ответов. Сходные данные были получены для 12 других клеток COS-1.
БЕЛОК-БЕЛКОВОЕ УЗНАВАНИЕ НА ПРИМЕРЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЦИТОХРОМА Р450 С БЕЛКОМ - ПЕРЕНОСЧИКОМ ЭЛЕКТРОНА.
В метаболизме многих веществ цитохромы Р450 ответственны за окисление лекарств и стероидов у человека, а бактериальные цитохромы P450 – за синтез собственного строительного материала, также путем окисления органических веществ. Для этого цитохромам P450 необходим электрон, поставляемый отрицательно заряженным белком-переносчиком электрона. Нами было выяснено, что электростатическое поле цитохромов Р450 различных биологических видов (как бактерий, так и млекопитающих) имеют область положительного потенциала, комплиментарную отрицательному потенциалу белка-переносчика. Наличие и величина этой области можно рассматривать как консервативное свойство цитохромов P450, поскольку оно характерно для всех исследованных цитохромов Р450 вне зависимости от степени гомологичности их аминокислотной последовательности. Такие области показаны на рисунке для трех весьма различных (идентичность аминокислотных последовательностей около 20%) цитохромов Р450. Таким образом, для всех цитохромов P450 была теоретически идентифицирована область их поверхности, ответственная за молекулярное узнавание белка-переносчика электрона.
Рис.1. Электростатический потенциал цитохромов холестерин-метаболизирующего цитохрома P450 человека (слева), цитохрома Р450 – монооксигеназы жирных кислот из Ваcillus megaterium (в центре) и человеческого цитохрома P450 – гидролазы прогестерона (справа). Синий цвет – положительный потенциал, красный – отрицательный, белый – нейтральный.