ПУРИНЭРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА ВКУСОВЫХ КЛЕТОК.
Исследовалась роль фосфоинозитидного каскада (фосфолипаза С - генерация IP3 - стимуляция IP3 рецептора – выброс Са2+ из внутриклеточных депо) и Са2+ как вторичного мессенджера в возбуждении вкусовых рецепторных клеток млекопитающих химическими стимулами, используя Са2+ индикатор Fura-2. Было показано, что экстраклеточный АТФ и другие нуклеотиты мобилизуют внутриклеточный Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток (Рис.1). В целом полученные фотометрические данные и данные ингибиторного анализа свидетельствовали о том, что вкусовые клетки экспрессируют метаботропные (P2Y) пуринорецепторы сцепленные с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией депонированного Са2+ Методами RT-PCR (обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция) и иммуногистохимии во вкусовых клетках идентифицированы ряд изоформ ферментов, которые могут быть вовлечены в пуринергическую сигнализацию и в другие сигнальные процессы, а именно, P2Y рецепторы - P2Y1, P2Y2, P2Y4 P2Y6; фосфолипаза С - PLCb2, PLCb4, PLCd1 и PLCd4; IP3-рецептор 3го типа.
Рис.1. Изменение интенсивности флуоресценции вкусовой клетки, нагруженной Са2+ зондом Fura-2, при аппликации АТФ. А, изображение вкусовой клетки во флуоресцентном свете (возбуждение - 340 нм, эмиссия - 510 нм) в контроле (а) и после аппликации АТФ (10 мкМ) (b). B, относительное изменение интенсивности флуоресценции Fura-2 свидетельствует о мобилизации внутриклеточного Са2+ в ответ на АТФ.
МЕХАНИЗМ АФФЕРЕНТНОЙ НЕЙРОПЕРЕДАЧИ ВО ВКУСОВОЙ ПОЧКЕ.
Ряд фактов свидетельствует о том, что АТФ является афферентным нейротрансмиттером и его секреция вкусовыми клетками - один из ключевых этапов вкусовой трансдукции. Нами исследовалась секреция АТФ идентифицированными вкусовыми клетками с использованием метода АТФ-биосенсора (Рис.2), и было установлено, что только клетки типа II высвобождали АТФ в ответ на деполяризацию. Выброс АТФ не зависел от внутриклеточного Са2+, что свидетельствовало против классического экзоцитозного механизма. Физиологические данные и анализ экспрессии ряда сигнальных и канальных белков указывал на то, что ATP высвобождается из вкусовых клеток через полупоры, формируемые коннексинами. Эти пионерские результаты объясняют отсутствие классических пресинаптических структур во вкусовых хеморецепторных клетках тем, что последние используют уникальный механизм, а не классические химические синапсы, для кодирования вкусовой информации
Рис.2 Мониторинг секреции одиночными АТФ вкусовыми клетками. Вкусовые клетки идентифицировались электрофизиологически. В качестве АТФ сенсора использовались клетки линии COS-1, которые экзогенно экспрессируют P2Y рецепторы, сопряженные с мобилизацией внутриклеточного Са2+.
ИОННЫЕ КАНАЛЫ СЕНСОРНЫХ КЛЕТОК.
Исследование ионных каналов различной природы является традиционным и одним из основных направлений лаборатории. Сотрудниками лаборатории открыты и исследованы несколько типов ионных каналов, функционирующих в сенсорных клетках. Наиболее важным результатом является открытие катионных каналов, которые активируются при связывании, как минимум, двух молекул циклического нуклеотида (Рис.1). Каналы этого типа были идентифицированы в палочках и колбочках сетчатки, в обонятельных нейронах и в волосковых клетках кортиева органа. Во вкусовых клетках впервые идентифицированы катионные каналы, которые ингибируются cGMP и cAMP. Как и в случае циклонуклеотид-активируемых каналов, ингибирование канальной активности циклическими нуклеотидами является прямым и не опосредовано процессами фосфорилирования.
Рис.1. Ток через фрагмент мембраны, изолированный из булавы обонятельного нейрона карпа, при мембранном потенциале -40 мВ. Фрагмент содержит пять цАМФ-активируемых катионных каналов. Циклический АМФ, приложенный с цитоплазматической стороны мембраны в субмикромолярных концентрациях, инициирует открывание одиночных каналов. При микромолярных концентрациях цАМФ активирует одновременно несколько каналов, что приводит к увеличению интегрального тока.
ИОННЫЕ КАНАЛЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК.
Как и у животных у растений есть электровозбудимые клетки, участвующие в генерации и распространении потенциалов действия, возникающих под действием различных внешних раздражителей (механических, температурных, химических и т.п.). В нашей лаборатории в качестве объекта для изучения ионных каналов растений используется водоросль Chara corallina. Регистрируются токи с небольшого(~ 2мм) участка клетки, выделенного изолирующими мостиками, в режиме фиксации напряжения или на двух мембранах или на одной плазмалемме. Во втором случае используется либо целая клетка с введением микроэлектрода в цитоплазму, либо диализируемая клетка с удаленной вакуолярной мембраной. В последнем случае обеспечивается контроль растворов с обеих сторон плазмалеммы. В целом разработанная методика позволяет регистрировать на плазмолемме интегральные токи, транспортируемые потенциал-зависимыми Ca2+-каналами, Ca2+-активируемыми Cl--каналами и К+-каналами, в совокупности обеспечивающих генерацию потенциала действия. Изучаются характеристики ионных каналов в эксперименте, разрабатываются теоретические модели их функционирования. В частности, полученные данные свидетельствуют о том, что электрическая возбудимость этих клеток обусловлена тем, что деполяризация вызывает вход наружного Са2+ в цитоплазму клетки и активацию Са2+-зависимой Сl- проводимости ее плазматической мембраны. Показано, что активность Сl- каналов пропорциональна квадрату концентрации ионов Са2+ и оценен предельный диаметр канальной поры.
Рис.2 Левая панель, фотография водоросли Chara corallina. Правая панель, типичные токи через плазматическую мембрану нативной клетки водоросли в режиме фиксации потенциала (черная линия). Ток в контроле (зеленая кривая) и после введения ингибитора хлорных каналов (красная кривая), когда остается в основном переходный ток кальциевых каналов.
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ВО ВКУСОВЫХ КЛЕТКАХ.
Проводился анализ экспрессии генов во вкусовой ткани, кодирующих ряд рецепторов, G-белков, эффекторных ферментов и ионных каналов, с использованием метода RT-PCR и ген-специфичных праймеров. В ряде случаев экспрессия подтверждена на уровне белка методами иммуногистохимии. Долгосрочной целью данных экспериментов является установление корреляции между функциональными свойствами клеток и типами сигнальных белков, экспрессируемых ими. Поскольку вкусовая ткань гетерогенна, то транскрипты, идентифицированные на уровне тотальных препаратов, невозможно однозначно приписать какой-либо из четырех клеточных линий, функционирующих во вкусовой почке. В связи с этим, отработана методика анализа экспрессии генов в одиночных идентифицированных клетках. С этой целью одиночная клетка характеризовалась электрофизиологически методом patch clamp, затем затягивалась в кончик регистрирующего электрода, содержимое которого затем выдавливалось в пробирку. Клеточный материал от 1-10 клеток собирался в одной пробирке для дальнейшего анализа с использованием методов RNA амплификации и PCR с ген-специфичными праймерами. Используя данный подход, в частности показано, что вкусовые клетки типа II экспрессируют канальные белки TRPM5, Cx36, Cx30.1, Cx33, Cx43 и Px1 (Рис.1).
Рис.1. Экспрессия сигнальных белков во вкусовых клеткапх типа II. А, продукты RNA амплификации и PCR c ген-специфичными праймерами свидетельствуют о экспрессии на уровне транскриптов генов, кодирующих ряд канальных белков (Cx26, 30.3, 31.1, 33, 36,43; Px1, TRPM5) и фосфолипазу Cb2 во вкусовых клетках типа II. Эксперимент выполнен с использованием тотальной RNA, выделенной из 10 идентифицированных вкусовых клеток. B, С, флуоресценция срезов желобоватого вкусового сосочка, прокрашенного флуоресцентными антителами к Px1 и фосфолипазе Cb2 (B) и Px1 и TRPM5 (С) свидетельствует о коэкспрессии данных белков.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ПУРИНЕРГИЧЕСКОГО СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА ВКУСОВЫХ КЛЕТОК.
Вкусовые клетки млекопитающих экспрессируют метаботропные пуринорецепторы P2Y типа, сопряженные с фосфоинозитидным каскадом (G-белок – фосфолипаза С – продукция IP3 – активация IP3-рецептора-мобилизация Са2+). Нами были исследованы ответы вкусовых клеток на ряд агонистов P2Y рецепторов в широком диапазоне концентраций (до 5 порядков) и получены кривые доза-ответ для различных агонистов и антагонистов. Полученные фармакологические данные свидетельствовали о том, что во вкусовых клетках функционирует рецептор нуклеотидов со свойствами, ранее не описанными для P2Y рецепторов, изученных при гетерологичной экспрессии. Для объяснения экспериментальных фактов была сформулирована гипотеза, согласно которой основные изоформы, экспрессируемые во вкусовых клетках (P2Y2 и P2Y4), функционируют в виде гомо- и гетеродимеров. С целью количественной проверки гипотезы разработана модель пуринергической Са2+ сигнализации в данном типе клеток, которая обеспечивает возможность расчета кривых доза-ответ для различных комбинаций P2Y рецепторов (мономерных и/или димерных). В основе модели лежат экспериментальные факты, согласно которым концентрация Са2+ и кинетика ее изменения в цитоплазме вкусовых клеток определяется четырьмя Са2+ потоками и Са2+ буферными системами цитоплазмы эндоплазматического ретикулума (Рис.1). Оказалось, что модель способна воспроизвести все экспериментальные концентрационные зависимости, но только в случае, если P2Y рецепторы предполагаются функционирующими в виде P2Y2/P2Y2 и P2Y4/P2Y4 гомодимеров и P2Y2/P2Y4. Это является серьезным аргументом в пользу димеризации P2Y рецепторов в специфических условиях цитоплазмы вкусовых клеток.
Рис.1 Упрощенная схема пуринергического сигнального каскада и систем Са2+ гомеостаза вкусовых клеток млекопитающих. Здесь Ga Gbg - субъединицы гетеротримерного G-белка, PLCb2 – фосфолипаза С (b2 изоформа), PIP2 – фосфатидилинозитол дифисфат, SOC – депо-управляемые Са2+ каналы, PMCA – Са2+-АТФаза плазмолеммы, SERCA – ретикулярная Са2+-АТФаза, ER – эндоплазматический ретикулум.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ДИНАМИКИ СА2+ В ЦИТОПЛАЗМЕ КЛЕТОК ВОДОРОСЛИ CHARA В ПРОЦЕССЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ.
Для анализа экспериментальных результатов, полученных при изучении системы ионных каналов, ответственных за электрическое возбуждение плазматической мембраны водоросли Chara, использовалась математическая модель, описывающая динамику внутриклеточного Са2+ в примембранном слое и активацию Cl- каналов ионами Са2+. Для расчета концентрации Са2+ возле Cl- каналов решалась задача диффузии ионов Са2+, входящих из внеклеточной среды через Са2+ каналы, в присутствии подвижного Са2+ буфера. При реалистических параметрах диффузионной системы, включая концентрацию буфера и его афинность к ионам Са2+, удалось получить хорошее соответствие расчетных и экспериментальных данных. В частности, удалось воспроизвести величину и кинетику и Са2+-активируемого Cl- тока. Результаты некоторых расчетов приведены на Рис.2.
Рис.2. (а) - Кинетика изменения относительной концентрации свободного Ca2+ около плазмалеммы. (б) - распределение [Ca2+] в цитоплазме в функции расстояния от мембраны в разные моменты времени (указаны при кривых). Входящий Са2+ ток задан в виде , где
= 8 мс, а значения I0 (A/м2) на рис. а указаны при кривых. Кривые на рис. б получены при I0 = 10 A/м2.