КЛОНИРОВАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ К+ КАНАЛОВ hERG ТИПА.
Токсическое действие многих лекарственных препаратов на сердце сводится к блокированию К+ каналов hERG типа и, как следствие, к пролонгированию фазы реполяризации и возникновению аритмий. Поэтому раннее выявление ингибирующих эффектов потенциального лекарства на активность К+ каналов, функционирующих в кардиомиоцитах, является важной задачей преклинического исследования. Нами проводились работы по получению клеточной линии, стабильно, воспроизводимо и на высоком уровне экспрессирующей рекомбинантные hERG каналы, что является необходимым условием для работы с клеточной тест-системой. Использовались два методически разных подхода, включая стандартную процедуру трансфекции клеток НЕК293 вектором pcDNA3.1 и трансфекция клеток СНО лентивирусным вектором pCDH1-MCS1-EF1-Puro. Получались субклоны клеток и исследовалась функциональная экспрессия hERG каналов методом patch clamp. Оценивалось среднее число активных каналов Np в различных субклонах, исходя из соотношения:
I = Npg(V-Vr) (1)
где I – ток, переносимый через ансамбль N функциональных каналов данного типа, p – вероятность найти канал в открытом состоянии, g - проводимость одиночного канала V и Vr – мембранный потенциал и потенциал реверсии тока, соответственно.
Рис.1 Среднее число hERG каналов на клетку в различных субклонах (e10-g3) pCDH1/HERG трансфецированных клеток CHO. Серый столбец - субклон клеток НЕК293, трансфецированных вектором pcDNA3.1/HERG, с максимальным уровнем экспрессии hERG каналов. Величина Np рассчитывалась на основе Ур.1 при g=13 пСм и Vr = (RT/F)log([K+]out/[K+]in)» 50 мВ при [K+]out = 40 мМ и [K+]in = 140 мМ.