ПУРИНЭРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА ВКУСОВЫХ КЛЕТОК.
Исследовалась роль фосфоинозитидного каскада (фосфолипаза С - генерация IP3 - стимуляция IP3 рецептора – выброс Са2+ из внутриклеточных депо) и Са2+ как вторичного мессенджера в возбуждении вкусовых рецепторных клеток млекопитающих химическими стимулами, используя Са2+ индикатор Fura-2. Было показано, что экстраклеточный АТФ и другие нуклеотиты мобилизуют внутриклеточный Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток (Рис.1). В целом полученные фотометрические данные и данные ингибиторного анализа свидетельствовали о том, что вкусовые клетки экспрессируют метаботропные (P2Y) пуринорецепторы сцепленные с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией депонированного Са2+ Методами RT-PCR (обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция) и иммуногистохимии во вкусовых клетках идентифицированы ряд изоформ ферментов, которые могут быть вовлечены в пуринергическую сигнализацию и в другие сигнальные процессы, а именно, P2Y рецепторы - P2Y1, P2Y2, P2Y4 P2Y6; фосфолипаза С - PLCb2, PLCb4, PLCd1 и PLCd4; IP3-рецептор 3го типа.
Рис.1. Изменение интенсивности флуоресценции вкусовой клетки, нагруженной Са2+ зондом Fura-2, при аппликации АТФ. А, изображение вкусовой клетки во флуоресцентном свете (возбуждение - 340 нм, эмиссия - 510 нм) в контроле (а) и после аппликации АТФ (10 мкМ) (b). B, относительное изменение интенсивности флуоресценции Fura-2 свидетельствует о мобилизации внутриклеточного Са2+ в ответ на АТФ.
МЕХАНИЗМ АФФЕРЕНТНОЙ НЕЙРОПЕРЕДАЧИ ВО ВКУСОВОЙ ПОЧКЕ.
Ряд фактов свидетельствует о том, что АТФ является афферентным нейротрансмиттером и его секреция вкусовыми клетками - один из ключевых этапов вкусовой трансдукции. Нами исследовалась секреция АТФ идентифицированными вкусовыми клетками с использованием метода АТФ-биосенсора (Рис.2), и было установлено, что только клетки типа II высвобождали АТФ в ответ на деполяризацию. Выброс АТФ не зависел от внутриклеточного Са2+, что свидетельствовало против классического экзоцитозного механизма. Физиологические данные и анализ экспрессии ряда сигнальных и канальных белков указывал на то, что ATP высвобождается из вкусовых клеток через полупоры, формируемые коннексинами. Эти пионерские результаты объясняют отсутствие классических пресинаптических структур во вкусовых хеморецепторных клетках тем, что последние используют уникальный механизм, а не классические химические синапсы, для кодирования вкусовой информации
Рис.2 Мониторинг секреции одиночными АТФ вкусовыми клетками. Вкусовые клетки идентифицировались электрофизиологически. В качестве АТФ сенсора использовались клетки линии COS-1, которые экзогенно экспрессируют P2Y рецепторы, сопряженные с мобилизацией внутриклеточного Са2+.