ИБК РАН
  

Поиск

Яндекс метрика

Яндекс.Метрика

Оптимизация ресурса

Баннеры

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА


Схема, иллюстрирующая биохимические и морфологические изменения при апоптозе

     Исследование молекулярно-клеточных механизмов устойчивости живых систем к действию неблагоприятных факторов окружающей среды- одна из центральных проблем биологии, медицины и экологии. Гибель клеток - необходимый процесс в жизни любого многоклеточного организма, направленный на удаление уже ненужных организму клеток при дальнейшем развитии, или из-за необходимости селекции клеток с трансформированным генетическим потенциалом, а также клеток, поврежденных действием сублетальных стимулов. Утеря способности клеток к нормальной физиологической гибели, наряду с бласттрансформацией, наиболее вероятная причина злокачественного перерождения. Работами сотрудников лаборатории внесен значительный вклад в изучение конкретных механизмов клеточной гибели по типу апоптоза и ее протекции. Разработан метод идентификации апоптозных клеток в популяции с использованием проточной цитометрии. Исследованы кинетические и количественные закономерности гибели разных видов клеток животных и человека при действии in vivo и in vitro различных неблагоприятных факторов (гамма-облучение, кортикоиды и др.), роль цитоскелета, связь пролиферации и апоптоза. Предложен способ дифференциации двух форм клеточной гибели- некроза и апоптоза, показано, что интерфазная гибель лимфоидных клеток животных и человека in vivo сопровождается межнуклеосомной фрагментацией ДНК, предшествующей увеличению проницаемости плазматической мембраны, разделением клеток на мембрано-замкнутые фрагменты. Учитывая возрастающий интерес к действию УФ-облучения на организм в связи с экологическими проблемами, а также успешный опыт применения УФ в медицине (УФ-облучение крови, лечение опухолей и др. заболеваний), проведены исследования по изучению влияния УФ на иммунокомпетентные клетки. Показано, что при определенных условиях УФ может вызывать не только индукцию, но и подавление клеточной гибели. Для реализации двойственного эффекта УФ необходима активация протеинкиназы С. Дозы УФ больше 20 Дж/м2, вызывают подавление радиационно- и гормонально-стимулированной гибели лимфоидных клеток, вне зависимости от последовательности действия стимулов. Подобное протектирующее действие УФ представляет интерес с двух точек зрения: защита клеток от гибели в тот момент, когда она необходима (протекторный эффект) и с точки зрения возможной последующей трансформации "выживших" клеток, что может явиться источником канцерогенного действия УФ на организм.

Патологические процессы в организме человека, вызванные действием эндотоксинов (липополисахаридов, LPS), в частности, эндотоксиновый шок, сопровождаются ингибированием апоптоза нейтрофилов. Исследовано взаимодействие механизмов активации и ингибирования апоптоза нейтрофилов при действием разных хемотипов эндотоксина (ЭТ) из E.coli показало, что максимальное ингибирование апоптоза нейтрофилов наблюдается для Re-LPS, не имеющего внешнего кора и полисахаридной цепи из исследованных хемотипов и имеющего более низкую скорость интернализации по сравнению с Ra-LPS. Установлена высокая эффективность действия УФС по отмене ЭТ-индуцированного ингибирования апоптоза нейтрофилов, обусловленная взаимодействием сигнальных путей регуляции апоптоза при действии индукторов и ингибиторов апоптоза..

Необходимость физической ассоциации белков в процессе передачи цитотоксических сигналов предполагает возможность регуляции апоптоза путем модификации белок-белковых взаимодействий. Исследование апоптоз-индуцирующего и модифицирующего действия двух гомобифункциональных кросслинкеров ( диметилсуберимидата (DMS) и 1,5-бис(сукцинимидо-оксикарбонилокси)-пентана (BSOCOP)) на трансформированные линии клеток человека (U-937, K562, HeLa, Raji и MCF7) показало, что бифункциональные кросслинкеры, в отличие от своих монофункциональных аналогов, во-первых, индуцируют клеточную гибель по типу апоптоза и, во-вторых, пути активации клеточной гибели различаются. DMS-индуцированный апоптоз сопровождался нарушениями клеточного цикла, связанными с изменением уровня транскрипции гена p21. DMS ингибировал экспрессию генов bcl-XL и bac, в то время как BSOCOP увеличивал экспрессию bax. Эти данные указывают на важную роль митохондрий в реализации апоптоза, индуцированного исследуемыми агентами. Кроме того, было обнаружено, что предобработка клеток DMS, но не BSOCOP, приводила к усилению клеточной чувствительности к TNF, но ингибировала действие анти-Fas цитотоксических антител, вероятно, за счет сшивки TNF-рецепторов. Полученные результаты могут служить основой для дальнейшего исследования противоопухолевых свойств химических бифункциональных кросс-линкеров.


1. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Действие различных хемотипов липополисахарида E. coli на апоптоз и активацию нейтрофилов человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006, Т. 147, № 8, С. 136-138.
2. Moshnikova A.B., Afanasyev V.N., Proussakova O.V., Chernyshov S., Gogvadze V., Beletsky I.P. Cytotoxic activity of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide is underlain by DNA interchain cross-linking. Cell Mol Life Sci., 2006, vol.63, No.2, p.229-234.
3. Тяжелова В.Г. Механизмы активации лимфоцитов периферической крови. М.: Наука, 2003, 190С.
4. Винокуров М.Г., Юринская М.М. Регуляция апоптоза нейтрофилов при действии липополисахаридов. Биологические мембраны, 2010, том 27, № 1, С. 18–27.

 

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА БТШ70 НА МИЕЛОИДНЫЕ КЛЕТКИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ РАЗНОЙ СТРУКТУРЫ

     Исследование действия экзогенного рекомбинантного белка теплового шока (БТШ70) на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты и макрофаги) показало высокую эффективность защиты этим белком исследованных фагоцитов от действия бактериальных липополисахаридов (LPS). Установлено, что LPS (в комбинации с БТШ70 или в условиях теплового шока (ТШ)) приводит к изменению уровня синтеза 8 белков в клетках макрофагальной клеточной линии J774: Grp94, Trap1, Dpysl2, Sqstm1, hnRNP K, Hspd1, Eno1, Annexin A5. Синтез белков Grp94 (относится к семейству БТШ90 эндоплазматического ретикулума) и Trap1 (митохондриальный БТШ75) значительно индуцировался в ответ на введение LPS, но снижался как при действии только БТШ70, так и при совместном действии БТШ70 и LPS и при 37oC и при ТШ. Синтез белка Annexin A5 при совместном действии БТШ70 и LPS значительно увеличивался при 37oC и несколько индуцировался при ТШ. В присутствии LPS значительно увеличивалась индукция Sqstm1 (убиквитин-связывающий белок), hnRNPK (участвующего в процессах окислительного стресса) и Dpysl2 (участвующего в реорганизации цитоскелета клеток) . При совместном действии БТШ70 и LPS при ТШ синтез Sqstm1 увеличивался значительно, а при 37oC несколько снижался. При совместном действии БТШ70 и LPS при ТШ синтез белков hnRNPK и Dpysl2 снижался, а при 37oC увеличивался. При ТШ происходило значительное увеличение синтеза Hspd1 (БТШ60 митохондрий). При совместном действии БТШ70 и LPS при ТШ и при 37oC происходило увеличение синтеза этого белка. При действии LPS (при ТШ и 37oC) происходит увеличение синтеза Eno1 (энолазы 1). А при совместном действии LPS и БТШ70 (при ТШ и 37oC) синтез Eno1 снижается. Таким образом, нами выявлены белки, синтез которых изменяется в ответ на введение экзогенного БТШ70 при действии LPS в условиях 37oC и теплового шока.


1. Vinokurov M, Ostrov V, Yurinskaya M, Garbuz D, Murashev A, Antonova O, Evgen'ev M. Recombinant human Hsp70 protects against lipoteichoic acid-induced inflammation manifestations at the cellular and organismal levels. Cell Stress Chaperones. 2012 Jan;17(1):89-101.
2. Рожкова Е.А., Зацепина О.Г., Юринская М.М., Винокуров М.Г., Евгеньев М.Б. Внеклеточный рекомбинантный человеческий белок теплового шока БТШ70 влияет на изменение спектра белков при активации макрофагов, индуцированной эндотоксином. Молекулярная биология, 2011, том 45, № 2, с. 386-390.
3. Юринская М.М., М. Б. Евгеньев, О. Ю. Антонова, М. Г. Винокуров. Экзогенный белок теплового шока HSP70 подавляет активацию нейтрофилов под действием бактериальных патогенов. Доклады Академии наук, 2010, том 435, № 3, С. 407-410.
4. Rozhkova E.,Yurinskaya M., Zatsepina O., Garbuz D., Surkov S, Murashev A., Ostrov V., Margulis B., Evgen’ev M, Vinokurov M. Exogenous mammalian extracellular HSP70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels. Annals of the New York Academy of Sciences, 2010, Jun;1197:94-107.
5. Юринская М.М., Винокуров М.Г., Зацепина О.Г., Гарбуз Д.Г., Гужова И.В., Рожкова Е.В., Сусликов А.В., Карпов В.Л., Евгеньев М.Б. Экзогенные белки теплового шока БТШ70 подавляют эндотоксин-индуцированную активацию нейтрофилов человека. Доклады Академии наук, 2009, Т. 426, № 3, С. 406-409.

 

НОВОЕ В РАЗВИТИИ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА МЕТАБОЛИЗМ: НЕМОНОТОННЫЕ ЗАВИСИМОСТИ ДОЗА - ЭФФЕКТ


     Структурно-метаболическая теория А.М.Кузина, продолжая общее направление исследований роли генетического аппарата клеток в лучевых эффектах, ввела понятие о клетке как активной среде. Представления о клетке как о динамичной системе близко характеру ответных реакций на внешние воздействия. Изучение дозовых зависимостей поражения и активации сигнальных систем, регулирующих жизнедеятельность клетки, представляется перспективным направлением в нелинейной молекулярной биологии. Ионизирующая радиация угнетает деление клеток. Однако, если мощность дозы радиации мала, то клетки продолжают делиться.

     
Активность орнитиндекарбоксилазы в органах при хроническом g-облучении крыс.

На рис 1 представлены результаты определения темпа клеточной пролиферации в тканях крыс, о которой судили по активности фермента орнитиндекарбоксилазы (ОДК)-лимитирующего фермента образования регуляторов клеточного деления - полиаминов. Животных облучали при мощностях доз, характерных для 30-ти км зоны Чернобыля (рис 1). Немонотоннные изменения активности ОДК в тканях облученных крыс показаны нами как после хронического (рис 1), так и после острого воздействия ионизирующей радиации на животных (рис 2).


1. Kolomiytseva IK., Slozhenikina L.V. Fialkovskaya L.A., Kulagina T.P., Markevich L.N.,Potekhina N.I., Nonmonotonous changes in metabolic parameters of tissues and cells under action ionizing radiation on animals. J. Biol. Physics 1999, 25, С. 325-338.
2. Slozhenikina L.V., FialkovskayaL.A., Kolomiytseva I.K. Ornithin decarboxylase in organs of rats followingchronic g-irradiation at low dose-rate. Int.J. Radiat. Biol. 1999, v. 75, p193-199.
3. Коломийцева И.К., Кулагина Т.П., Маркевич Л.Н., Потехина Н.И., Сложеникина Л.В., Фиалковская Л.А. Немонотонность метаболического ответа клеток и тканей млекопитающих на воздействие ионизирующей радиации. Биофизика, 2002, т.47, вып.6, с. 1106-1115.

 

ЛИПИДЫ МЕМБРАН: РОЛЬ В ЛУЧЕВОМ ПОРАЖЕНИИ И ВОССТАНОВЛЕНИИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Идеи о клетке как об активной среде, осуществляющей гомеостаз за счет прямых и обратных связей, дают новый импульс исследованиям роли сигнальных механизмов в лучевых эффектах, в частности, роли сигнальных липидов, входящих в состав клеточных мембран и органелл, в механизмах апоптоза и регенерации клеток. Мы исследуем локализацию структурных липидов в клетках в норме и при лучевом или низкотемпературном воздействии (гипотермии) на млекопитающих. Нами установлено, что активация новообразования липидов, в частности, холестерина, тесно связана с процессами постлучевого восстановления клеток, а печень является органом, синтезирующим холестерин для всего организма. При активации синтеза белков в клетках коры головного мозга (при переходе от спячки к бодрствованию), а также при лучевой активации синтеза белков в печени, в мембранах эндоплазматического ретикулума этих органов растет количество холестерина. Эти данные свидетельствуют о важности исследования роли липидов в регуляции функции рибосом. Нами получены данные о глубоких изменениях количества холестерина в ядрах глии коры головного мозга крыс при воздействии рентгеновского излучения и гипотермии. Ядра не располагают собственными системами синтеза холестерина, и изменения его количества может происходить только за счет изменений транспорта. Уменьшение количества фосфатилинозитола в ядрах глии облученных крыс свидетельствует об участии инозитолфосфатного цикла ядра в реакциях глиальных клеток на действие радиации. Перспективными являются исследования роли липидов хроматина в устойчивости организма к действию повреждающих факторов окружающей среды.


1. Kolomiytseva I.K., Kulagina T.P., Markevich L.N., Archipov V.I., Slozhenikina L.V., Fialkovskaya. L.A., Potekhina N. I. Nuclear and chromatin lipids: metabolism in normal and gamma-irradiated rats. Bioelectrochemistry, 2002, 58 (1).p. 31-39.
2. КулагинаТ.П., Маркевич Л.Н., Коломийцева И.К., Алесенко А.В. Синтез липидов визолированных ядрах клеток тимуса и печени крыс. Биохимия, 2003, т. 68, вып. 5,с. 698-705.
3. Коломийцева И.К., Перепелкина Н.И., Патрушев И.В.., Попов В.И. Роль липидов в сборке эндоплазматического ретикулума и диктиосом нейрональных клеток коры головного мозга якутского суслика Citellus undulatus при гибернации, Биохимия, 2003, т.68, вып.7, с.954-967.

 

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ К ЕСТЕСТВЕННОМУ И ИСКУССТВЕННОМУ ГИПОБИОЗУ.

Способность некоторых видов млекопитающих переживать неблагоприятные условия окружающей среды (холод, низкое содержание кислорода, голод) путем погружение в гипобиоз представляет большой интерес для фундаментальной биологии и космической медицины. В лаборатории развиваются два связанных между собой направления- исследование метаболизма липидов и роли полиаминов при естественном и искусственном гипобиозе. Структурная организация живых систем представляет главную проблему постгеномной молекулярной биологии. Липиды, располагающие гидрофобными и ионными свойствами, являются организаторами внутриклеточного пространства, создавая нанноструктуры живого вещества со свойствами, обеспечивающими высочайшую скорость взаимодействия и самоорганизации. Полиамины, в свою очередь, модифицируют свойства высокоорганизованных макромолекул и биоструктур.


1. 1. Kolomiytseva I.K, Perepelkina N.I., Zharikova A.D., Popov V.I. Membrane lipids and morphology of brain cortex synaptosomes isolated from hibernating Yakutian ground squirrel. Comp. Biochem. Physiol. B, 2008, v.151, p.386-391.
2. I.K. Kolomiytseva*, L. N. Markevich, D. A. Ignat’ev, and O. V. Bykova. Lipids of Nuclear Fractions from Neurons and Glia of Rat Neocortex under Conditions of Artificial Hypobiosis.// Biochemistry (Moscow), 2010, Vol. 75, No. 9, pp. 1132-1138.
3. G. E. Aksyonova, O. S. Logvinovich, L. A. Fialkovskaya, V. N. Afanasyev, D. A. Ignat’ev, and I. K. Kolomiytseva* Ornithine Decarboxylase Activity in Rat Organs and Tissues under Artificial Hypobiosis Biochemistry (Moscow), 2010, Vol. 75, No. 9, pp. 1126-1131.
4. Коломийцева И.К. Липиды в гибернации и искусственном гипобиозе млекопитающих. //Биохимия, 2011,том 76, вып. 12, с. 1604 – 1614.